“基因组编辑”是如何如此迅速地成为家喻户晓的词汇的？投资公司Versant Ventures的Jerel Davis是在华盛顿西雅图举行的2019年生命科学创新西北（LSINW）大会上开启的一个基因编辑小组里提出了这个问题。“基因组编辑是两项发现的并列，”来自基因和细胞治疗公司Bluebird Bio的小组成员Philip Gregory解释道：核酸酶可以在特定序列上造成双链DNA断裂（DSBs），而DSBs激活可以改变DNA的修复。
DSB修复有两种机制。非同源末端连接（NHEJ）将末端连接在一起，通常在此过程中产生插入和删除(indels)。在基因组编辑中，这可以用于敲除基因功能。同源介导修复（HDR）使用序列相似的DNA修复DSB。为细胞提供外部同源供体DNA可通过HDR进行编辑。
许多基因组编辑系统通过使用工程化锌指核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）或归巢核酸内切酶在特定位点激活DSB修复来发挥作用(1)。目前，主要的基因组编辑方法是CRISPR-Cas9（规律成簇的间隔短回文重复序列相关蛋白9）(2)。研究人员如何在这些系统中进行选择？
“主要考虑的是最终产品，”位于波特兰的俄勒冈健康与科学大学的Jon Hennebold表示。Hennebold领导着一个由美国国立卫生研究院资助的关于基因组编辑效率和安全性的多站点项目。公司使用专为特异性而优化的专有基因组编辑系统，以减少脱靶效应（意外位点的突变）。大多数学术实验室都可以通过CRISPR获得他们想要的产品，这既快捷又简单。“你可以订购组件，并在24到48小时内开始使用，”Hennebold说，“其他方法没有这种商业支持。”
CRISPR：它能完成任务
“学术实验室没有理由使用其他方法，”位于北卡罗来纳州达勒姆的杜克大学生物医学工程师Charles Gersbach说。“对于普通的基因组编辑，Cas9和gRNA将完成这项工作。”Cas9是一种来自细菌抗病毒系统的酶，它在与引导RNA（gRNA）互补的DNA位点上产生DSB，并且在其附近还有一个前间区序列邻近基序（PAM）序列。编辑不需要CRISPR重复，所以Cas9加上一个gRNA可以通过NHEJ敲除基因。提供一个DNA片段可促进HDR介导的编辑。
西雅图艾伦细胞科学研究所干细胞和基因编辑主任，也是LSINW小组成员的Ru Gunawardane指出，CRISPR在完成该研究所的使命——即了解细胞在正常、疾病和治疗条件下是如何行动的方面一直是“游戏规则的改变者”。该研究所的研究人员在含有荧光蛋白的干细胞中使用CRISPR标记细胞器标记物，然后跟踪这些融合蛋白及其在不同情况下的相互作用。目前，他们的工作包括将标记细胞分化为心肌细胞。
“到目前为止，我们已经标记了40到50个位点，”Gunawardane说。“一旦你拥有CRISPR平台，你只需要改变gRNA和在基因组中正确位置引入标签的模板。”然而，在将这些细胞用于实验或用于研究之前，研究所的研究人员会进行数月的下游质量控制，如实时成像和测序。
中国科学院植物生物学家高彩霞（音译）表示，CRISPR在自己的研究领域也很常见。“所有方法在产生位点特异性突变方面都非常有效，”她说，“但CRISPR花费的时间最少，成本也最低。”
CRISPR替代品
不过，CRISPR介导的基因组编辑也有缺陷。PAM要求限制目标序列。Cas9体积很大，因此其基因很难通过基因治疗中常用的腺相关病毒等载体传递到细胞中。科学家们担心脱靶效应，尽管专家指出，对意外突变的担忧往往是基于改进编辑研究的计算。这些研究可能故意使用低特异性条件来促进监测进展。
为了确保对其产品的最高信心，公司在专注于效率和特异性的定制基因组编辑方法上投入了时间和金钱。行业科学家表示，初期投资可以通过防止开发后期出现问题来获得回报。
ZFNs是位于加州布里斯班的基因组医学公司Sangamo使用的基因组编辑试剂。首席技术官Ed Rebar解释称，Sangamo公司的核心编辑试剂是ZFN二聚体。典型的目标位点是36个碱基对。每个ZFN都是来自FokI限制性内切酶的核酸酶结构域的嵌合蛋白以及一系列锌指DNA结构域，这些结构域是由Sangamo公司数千个双指亚基档案“混合和匹配”而构建的。使ZFN结构多样化以实现高靶向能力的策略包括将FokI域附加到锌指阵列的N-或C-末端，并在手指之间插入碱基跳跃连接子。借助Sangamo公司用于生成ZFN的高通量、自动化过程，Rebar表示，“从目标基因名称开始，我们可以在两周内生成一套初始编辑试剂。”
在一项展示研究中，Rebar和同事设计的ZFNs，在与研究血红蛋白病相关的启动子中的28个碱基中的25个碱基插入缺失突变(3)。尽管具有这种精度和比Cas9小的优势，但ZFNs并不像基于CRISPR的方法那样普遍使用。Sangamo公司通过产业界和学术界的合作关系提供ZFNs，但拥有制造它们的模块、专业知识和专利。
TALENs将FokI连接到最初来自植物病原体的DNA结合模块阵列上，每个模块都靶向一个碱基对。TALENs比Cas9小，但比ZFNs大。这些模块具有较高的DNA结合亲和力，但也包含了会给克隆带来挑战的重复序列。
Dan Carlson是Recombinetics的首席科学官。Recombinetics是一家总部位于明尼苏达州圣保罗的生物技术公司，该公司利用TALENs和CRISPR技术为临床研究模型和农业生成动物和细胞系。他说，使用这些方法，“我们几乎可以瞄准基因组中的任何位点。”Carlson补充道，凭借内部资源，即使是TALENs也只需要“几百美元和大约一周”即可生成，所以科学家们会根据试点研究选择最具重复性、一致性和针对性的方法。他指出，这些初始投资确保公司对资源负责。“在后端解决问题的成本太高了。”
Meganucleases，即归巢核酸内切酶，尽管它的名字指的是长度可达40个碱基对的识别序列，但它比Cas9要小。单链融合酶megaTALs将TALENS的简单组装和归巢内切酶的DNA切割特异性结合起来。位于马萨诸塞州剑桥的Bluebird Bio和位于北卡罗来纳州达勒姆的Precision BioSciences是两家使用基于归巢核酸内切酶方法的生物技术公司。
位于西雅图的福瑞德·哈金森癌症研究中心结构生物学家Barry Stoddard拥有一组50~60种归巢核酸内切酶，他的实验室工程师可以用来识别特定的序列。“制造CRISPR以靶向基因需要一天的时间，”他说，“而制造一个归巢核酸内切酶则需要100天。”尽管如此，Stoddard还是收到了很多工程化归巢核酸内切酶的请求，因为它们的精确度在诸如开发“100天不算什么”的疗法等应用中具有很高的价值。
是否需要DSB
依靠HDR进行编辑可能会导致插入缺失或染色体易位。Stoddard观察到，即便是精确定位的核酸酶，使用HDR“你也会受到细胞的支配。”他补充道，要想在没有HDR不可预测性的情况下进行编辑，需要关注特异位点重组酶（SSRs）的发展。
“SSRs可以做所有的事情，”苏格兰格拉斯哥大学分子遗传学家Marshall Stark表示。“它们在不需要宿主因素的情况下断开并重新连接DNA。”即使在低HDR或没有HDR的细胞中，SSRs也可以在目标位点整合外源DNA。Stark说，在最佳条件下，“SSRs可以非常高效，在几分钟内重组接近100%。”SSRs可以进行类似开关的改变，比如逆转DNA片段的方向。这使得它们在为工业目的或合成生物学应用创建出控制细胞行为的类似电子电路的路径方面很有价值，如制造生物计算机。然而，SSRs具有复杂、罕见、30~50个碱基对的靶位点。
Stark提出了两种使SSRs适应更广泛的基因组编辑的方法：（1）利用定向进化来选择新的特异性靶标；（2）制造融合蛋白。例如，他和其他人正在将SSR衍生的重组酶结构域连接到结合特定DNA序列的锌指模块上。这项技术“仍处于调查阶段，”Stark指出。“如果你心中有一个特定的目标，那么为它制造重组酶仍有很多工作要做。”
对于没有DSBs的基因组编辑，研究人员使用仍然由gRNA控制，但不切割DNA或只产生单链切口的Cas9。Cas9变体与转录激活因子或抑制因子融合，或者与酶融合，通过修饰DNA或DNA包装组蛋白来改变基因表达，从而改变染色质结构。这种表观基因组编辑类似于自然基因调控，Gersbach说，“没有DNA序列脱靶改变的风险。”该方法是研究表观遗传学的基础研究工具，具有潜在的治疗用途，例如重新激活导致智力残疾的脆性X染色体综合征的沉默基因(4)。
碱基编辑使单碱基对改变，同时避免了DSB修复中的意外突变。它适用于没有HDR的细胞。这种方法的创新定期发表，但哈佛大学的David Liu小组开发的第一个碱基编辑器有一个靶向DNA序列的失活Cas9与一种能将胞嘧啶转化为尿嘧啶的酶融合。融合蛋白将胞嘧啶—鸟嘌呤变成胸腺嘧啶—腺嘌呤。另一个碱基编辑器是Liu的实验室通过蛋白质工程和定向进化产生的，它将腺嘌呤—胸腺嘧啶改变为鸟嘌呤—胞嘧啶。Liu断言，仅仅这两种碱基编辑系统就能改变三分之一的碱基对，并有可能纠正62%的已知人类致病点突变。
Liu指出，截至2019年夏天，已有100多篇研究论文描述了使用碱基编辑的实验，“其中有几篇是通过直接逆转点突变来纠正人类遗传疾病的动物模型的实验。”例如，一个编辑器纠正了导致苯丙酮尿症的突变(5)。Liu和其他人正在使碱基编辑多样化——扩大碱基改变选项，增加特异性，并提高活体动物和需要区分高度相似序列的靶点的活性。
基因编辑的未来
作为一名使用基因组编辑技术的科学家，Carlson希望研究人员将其应用于造福人类和地球。他希望公众明白，获得最终产品实际上是一个漫长的过程。生物技术公司Recombinetics因为使用TALENs来繁殖无角牛（这省去了农民去角的麻烦）而受到媒体的关注。该项目始于2012年，Carlson表示，公司将继续致力于提高编辑效率。
鉴于CRISPR的普及和可用性，它在基因组编辑预测中占据主导地位。Carlson表示，基于CRISPR的系统将继续不断改进。研究人员定期发表具有更高效率或特异性的改良gRNAs。已经发现或改造了多种具有不同PAMs或活性的Cas型酶 (6)。例如，Cas13靶向RNA，是RNA碱基编辑的基础。这种方法和Liu的DNA碱基编辑技术被Beam Therapeutics公司授权使用，该公司的联合创始人包括Liu和张锋（音译），他们开发了哺乳动物细胞的CRISPR。
CRISPR方法上的改进包括在编辑过程中用小分子处理细胞，将DSB修复从NHEJ向HDR方向推进。可控系统使用光或小分子打开Cas9，限制其活性，以减少脱靶效应。研究人员正在微生物界中搜寻新的Cas型酶和全新的基因组编辑系统。“我们仍在识别具有编辑能力的新分子，我们还没有完全了解我们拥有的编辑工具，”Hennebold说道。“我们还有很多东西要学。”
使用CRISPR纠正致病突变的实践正在增长：Editas Medicine和Allergan宣布了针对遗传性失明的人体CRISPR治疗试验。治疗性CRISPR的一个潜在障碍是人类可能对其细菌成分产生免疫反应。例如，大多数被检测的血液样本显示存在对Cas9的免疫反应，而Cas9通常取自葡萄球菌或链球菌(7)。
基因组编辑的愿望清单包括更好的多路复用方法——一次编辑多个基因。例如，多路复用将加快基于T细胞的免疫疗法的发展，这种疗法适用于许多患者，但需要改变多个基因。植物科学家们经常想要创造连锁基因的“堆叠”，这些基因可以一起遗传，以抵御疾病、害虫和其他农业威胁。多路复用将加速这些产品的创建。
原则上，CRISPR的多路复用很简单，只需要为每个靶向基因引入单个Cas酶以及gRNA和模板DNA。Gunawardane曾尝试使用CRISPR多路复用技术来标记同一细胞中的多个基因，并表示这是可以实现的，但在实践中，随着每个添加基因的增加，情况会变得越来越复杂。使用SSRs、ZFNs或归巢核酸内切酶的系统可能具有一些优势，比如更小的组件更容易被导入。
当向科学家询问有关基因组编辑的挑战时，他们会提到将组件递送入细胞。他们说，要注意将编辑酶作为蛋白质而不是基因传递的瞬时系统，这样，蛋白质在作用后就会降解，而不是持续表达。以这种方式限制活动可以减少脱靶效应。高彩霞（音译）指出，基因组编辑系统的DNA独立递送可以缓解对转基因生物的担忧。“蛋白质不能整合到基因组中，”她说，“因此，如果根本没有外源DNA被递送，那么由此产生的植物应该被视为非转基因植物。”
高彩霞（音译）指出，CRISPR已经非常强大，所以很多人都在研究它和其他基因组编辑系统，它们将不可避免地继续改进。“科学家们喜欢制造新工具和新技术，”她说，“所以我们真的每天都能看到进步。现在，我们说原则上我们可以编辑任何目标，但五年后这将成为现实。”■
参考文献
1. A. J. Bogdanove, et al., Nucleic Acids Res. 46, 4845-4871 (2018), doi: 10.1093/nar/gky289.
2. A. C. Komor, A. H. Badran, D. R. Liu, Cell 168, 20-36 (2017), doi: 10.1016/j.cell.2016.10.044.
3. D. E. Paschon et al., Nat. Comm. 10, 1133 (2019), doi: 10.1038/s41467-019-08867-x.
4. X. S. Liu et al., Cell 172, 979-992 (2018), doi: 10.1016/j.cell.2018.01.012.
5. L. Villiger et al., Nat. Med. 24, 1519-1525 (2018), doi: 10.1038/s41591-018-0209-1.
6. A. Pickar-Oliver, C. A. Gersbach, Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 20, 490-507 (2019), doi: 10.1038/s41580-019-0131-5.
7. C. T. Charlesworth et al., Nat. Med. 25, 249-254 (2019), doi: 10.1038/s41591-018-0326-x.
Chris Tachibana是美国西雅图和丹麦哥本哈根的科学作家。
鸣谢：“原文由美国科学促进会（www.aaas.org）发布在2019年9月27日《科学》杂志”。官方英文版请见https://www.sciencemag.org/features/2019/09/beyond-crispr-what-s-current-and-upcoming-genome-editing。