Bridget Carragher表示，几十年来，冷冻电镜技术（cryo-EM）一直是一个“小众且狭小”的领域。但在2017年，冷冻电镜技术通过了蛋白质数据库（Protein Data Bank）——世界上唯一的蛋白质、核酸和大型生物分子3D结构的数据资源库——中多项年度条目的核磁共振波谱（NMR）。现在，它正在超越结构方法的鼻祖——X射线晶体学。
Carragher在纽约结构生物学中心领导一个由美国国立卫生研究院（NIH）和西蒙斯基金会支持的冷冻电镜设施。另外两个NIH资助的中心在斯坦福大学和俄勒冈健康与科学大学（OHSU）。奥尔胡斯大学结构生物学家Poul Nissen表示：“各地的趋势是使用国家冷冻电镜设施。”
随着软件和硬件的突破，特别是在电子探测器方面的突破，国家中心服务的冷冻电镜技术团体正在迅速扩大，展示了冷冻电镜技术是如何推进基础研究、药物开发甚至太阳能电池技术的。
晶体分辨率——没有晶体，但要付出代价
与X射线晶体学不同，冷冻电镜技术不需要结晶样品，这省去了一个耗时的步骤，并允许在原子级重建块状复合体和完整的膜蛋白，阻止结晶。它可以显示构象的变化，例如核糖体在蛋白质合成过程中会弯曲其结构。
冷冻电镜技术适用于未染色的水性样品。对于单粒子分析（SPA），这是其最常见的应用。研究人员将样品放到一个网格上，该网格通过注入液态乙烷急速冷却。这种冷冻——或者更确切地说是玻璃化——是如此之快，以至于样品分子被固定，其结构得以保持不变，而且没有干扰透射电子显微镜（TEM）的冰晶。然后，研究人员通过将电子束穿过样品来拍摄数千张TEM图像。以随机方向捕获的分子会散射电子，从而创建用于生成3D模型的模式。
NIH冷冻电镜技术中心副主任Craig Yoshioka指出了一个很有前途的发展：通过截短或突变蛋白质来诱变成晶体的晶体学家，现在可以使用冷冻电镜技术研究完整的野生型蛋白质。“这应该能更好地代表其天然状态的靶标，包括像糖基化这样的翻译后修饰。”
目前，SPA最适用于200kDa左右的大样本，所以研究较小蛋白质的研究人员可能会转向微晶电子衍射（microED），这是一种具有更大尺寸范围的冷冻电镜技术。SPA的另一个问题是它使用细胞提取物，但在细胞内部，“蛋白质不是漂浮在水中的。它们与其他成分相互作用或形成网络，在提取过程中破裂”，加州大学圣地亚哥分校生物物理学家Elizabeth Villa表示。Villa使用冷冻电子断层扫描技术（cryo-ET）对细胞甚至组织切片进行成像，从而在原位可视化组件。
而且冷冻电镜技术有一个最大的缺点：成本。顶级的300千电子伏特（keV）冷冻电镜机器价值约为500万至700万美元。
制药公司可能有内部设施或使用像NanoImaging Services这样的公司提供的设备。该公司联合创始人Carragher指出，大多数冷冻电镜客户来自制药或生物技术公司，示例项目包括分析疫苗、抗体和药物靶标。在冷冻电镜承包商中，该公司是少有的拥有自己设备的公司，而其他公司通常使用合作机构的设备。
主要的研究机构也投资于冷冻电镜设备，但规模较小的大学负担不起。然而，包括Gabriel Lander团队在内的斯克里普斯研究所的科学家们使用功率较低的100keV或200keV显微镜揭示了蛋白质的单埃（Å）结构，花费了100万~200万美元。这些结果鼓励了那些呼吁使用更实惠、更耐用的仪器使冷冻电镜技术大众化的科学家。
共同体服务
由于新的NIH中心拥有尖端设备并专注于服务和培训，冷冻电镜技术的使用应该会增加，而且培训中心的人员不得成为用户出版物的合著者。据Yoshioka估计，在满负荷运转的情况下，俄勒冈健康与科学大学站点将在同一时间收集200~300个活跃项目的24/7全天候数据，每年培训50多名来访科学家。他预计每个中心每年将会进行数百次重建。
而且服务是免费的。“你写了一份提案。”Carragher说，“如果它基于科学价值、可行性和需求等标准被接受，你就会得到冷冻电镜技术的使用时间。”这个模型类似于国家同步加速器设施，而且还有许多这样的设施，例如英国钻石光源的电子生物成像中心和巴西能源和材料研究中心的巴西纳米技术国家实验室（LNNano），都位于同步加速器附近。
LNNano研究员Rodrigo Portugal表示，工业客户需要支付服务费用，但在项目评估后，对学术研究人员的服务和培训是免费的。
LNNano高级科学家Marin van Heel指出，冷冻电镜技术是基于结构的药物和疫苗设计的强大工具，由于“像寨卡等被忽视的疾病的需求巨大”，因此它在该地区至关重要。LNNano正在与巴西、秘鲁、乌拉圭和阿根廷的合作伙伴进行SPA研究。
除了成本，LNNano设施的主要负担是人才流失。尽管举办了多场研讨会和一年一度的巴西单粒子冷冻电镜学院，但“人们还是会被另一个国家的中心或制药公司挖走”，van Heel直言。
“这是问题所在”
冷冻电镜技术的软件和硬件已经得到了“突飞猛进”的发展。Yoshika说：“但要可靠地将任何蛋白质从基因中提取到结构中仍然很困难。”冷冻电镜技术不需要大晶体，但样品纯度、异质性和浓度仍然很重要。
“样品准备不是问题。”Carragher说。在玻璃化过程中，“颗粒自身会粘合在一起，粘附在空气—水界面上，形成不稳定的构象或者解体。”商用自动化系统使样品制备更加可靠。然而，下游的挑战是由需要专用工作站的tb级数据引起的。
数字化的发展
冷冻电镜技术的用户们一致称赞软件小组在数据分析和结构解析方面的进步。Yoshioka表示，开源软件如来自英国医学研究委员会分子生物学实验室Sjors Scheres的RELION，以及包括Janelia研究园区和马萨诸塞大学的Niko grigoriieff在内的其他人的工作对该领域发挥了重要作用。他指出，计算技术的一个新兴的进步是数据收集时的实时处理和重构。
这正是cryoSPARC Live所做的。该软件由多伦多大学的子公司Structura Biotechnology开发，目前正在进行beta测试，该公司由Ali Punjani和Saara Virani兄妹团队运营。CryoSPARC Live增加了SPA工具的CryoSPARC包，包括2D图像管理和3D重建，而无需事先了解结构知识。
Virani指出，CryoSPARC Live会在几分钟后显示初始图像，在大约一小时内显示6-Å到8-Å的3D结构，并在几小时后显示精细的高分辨率结构。她说，研究人员可以进行实时调整，比如移动样本以专注于最佳领域，并决定要收集多少数据，从而节省时间和金钱。随着冷冻电镜技术需求的迅速增长，该领域正在努力解决商业化问题。Punjani解释道，cryoSPARC对学术用户是免费的，而制药公司等商业客户必须购买许可证。
Punjani指出，从冷冻电镜技术大众化的计算角度来看，是为了改进算法，以从低端显微镜获得更好的图像。此外，云托管的计算可以让实验室根据需要租用处理时间，而不用投资专用的硬件。
全力以赴创新
“在一段时间内，单粒子将成为高分辨率冷冻电镜技术的基本方法。”Yoshioka说。其他领域的进展扩大了解析结构的尺寸范围，并允许细胞内部的视图。
获得小于100kDa的蛋白质的高分辨率图像，推动了目前SPA的极限。由Tamir Gonen团队开发的MicroED实现了尺寸范围超过200kDa的配合物到10个碳原子以下的有机分子的原子分辨率。在加州大学洛杉矶分校工作的Gonen解释称，MicroED使用的晶体尺寸是X射线晶体学所需尺寸的十亿分之一。在MicroED中，玻璃化作用保护了样品，从而使单个微晶体通过电子束旋转而产生衍射图案，捕捉其分子三维重建的所有角度。
Gonen使用MicroED来观察钠离子通过通道时的结构变化。“因为我们使用的晶体只包含大约1000个单元，我们可以梳理出较小的差异，并捕捉到过渡态。”
药物化学家、法医学家和药物开发人员都对MicroED“粉末到结构”的应用感到兴奋。Gonen的研究小组和其他研究人员发表了一种30分钟内通过结构（包括混合物）识别小分子（如布洛芬或生物素）的方法。
Gonen与赛默飞世尔科技公司合作开发了相对易于使用的MicroED硬件和软件。“现在你不需要知道太多，就可以将样本放入‘范围’并收集数据。它可以让学界更容易获得MicroED。”他说。赛默飞世尔科技公司产品营销总监Steve Reyntjens表示，MicroED套件很容易作为一个可选项目添加到新显微镜上，或作为现有仪器的改装件。
加州大学洛杉矶分校的David Geffen 医学院有一个MicroED中心，其与学术和行业科学家合作并提供MicroED培训，包括在2020年10月举行的年度峰会上提供培训。
Villa指出，Cryo-ET揭示的细胞内容并不像教科书或视频中出现的那样“有一个空的空间，一个粒子，然后是空的空间”，它显示细胞中充满了分子。
TEM需要比大多数细胞更薄的样品，所以像Villa这样的研究人员将cryo-ET与聚焦离子束（FIB）微加工技术结合起来。Villa认为纽约州卫生部的Mike Marko证明了这种典型的材料科学方法对玻璃化样品是可行的。作为马克斯•普朗克生物化学研究所Wolfgang Baumeister实验室的博士后，Villa帮助推动了这项技术的发展。
Cryo-FIB使用一种特殊的冷冻电镜仪器，该仪器将一束大型离子束对准玻璃化样品以使其平整。“从细胞的顶部和底部进行爆破，直到细胞侧面有一个足够薄的窗口，就可以进行cryo-ET。”Villa说。
Villa的实验室在cryo-ET中添加了相关的光电子显微镜（CLEM），以确定LRRK2的14-Å结构。研究人员标记了这种与帕金森病有关的蛋白质，以使用CLEM将其定位到细胞中。然后，他们使用FIB对细胞进行细化，以获得LRRK2的原位3D结构，包括其与微管密切相关。LRRK2不能结晶，“但通过cyro-ET和亚断层图像平均，我们解决了它在细胞中的结构问题”，Villa说。
根据Villa的说法，未来对cyro-ET技术的改进包括在诱导改变之前，开发专门的TEM网格来培养细胞。Villa指出，使用光学显微镜的研究人员可以选择何时将样本玻璃化以进行cyro-ET实验，以高分辨率观察你对细胞进行某些操作时发生的情况。
cyro-ET的样品制备是低通量的，但是欧洲分子生物学实验室John Briggs小组开发的一种具有多重荧光标记的CLEM变体可以更快地识别cyro-ET细胞。Nissen说，cyro-ET将允许在其原生环境和整个组织中观察分子，例如神经元间相互作用的“连接体”的分子视图。
美国国立卫生研究院将很快启动国家cyro-ET中心。Carragher解释道，当前的冷冻电镜中心会在用户准备好cyro-ET样本时收集断层扫描图。国家中心将提供设备使用权，并协助进行棘手的cyro-ET标本制备。
除了像CLEM这样的发展之外，结合冷冻电镜技术和来自多个来源数据的结构分析正在兴起。“人们越来越多地使用晶体学、核磁共振、CLEM、质谱等各种方法来得到答案。但如果我们希望每个人都能拥有这些工具，它们就需要更容易获得。” Carragher说。
新的抱负
Nissen观察到，在解决访问问题的同时，该领域应该将其视角从只关注结构转变为询问结构在其原生状态下在细胞中的作用。“在自然环境中获得无标签、时间解析的结构是我们的最终目标，也是培养学生和博士后的一个新目标。”
Nissen和其他人预测，冷冻电镜技术在开发抗体疗法、小分子药物和诊断方面的工业应用将会越来越多。“我们还应该与医学界合作，解决尚未满足的诊断需求。在这些需求中，组织学无法显示出疾病组织和健康组织之间的良好区别，我们可以通过使用cryo-ET来发现组织中的分子差异。”
van Heel帮助开发了冷冻电镜技术，并目睹了它的使用增长。他在谈到该领域工作时指出：“目前这很具有挑战性，这是一个伟大的生存时代，没时间度假了。”■
参考文献
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Chris Tachibana 是生命科学领域的自由撰稿人。
鸣谢：“原文由美国科学促进会（www.aaas.org）发布在2020年3月20日《科学》杂志”。官方英文版请见https://www.science.org/content/article/democratizing-cryo-em-broadening-access-expanding-field。