自从17世纪自学成才的安东尼•范•列文虎克透过手工制作的镜片发现了一群“微小动物”以来，科学家们一直在努力进行更近距离的观察。随着分子生物学的出现，生物学家对细胞的研究主要集中在逐渐变小的结构的多样性上，近年来也专注于研究逐渐缩小的样本。
缩小样本量对于理解多细胞生物学的一个核心悖论是很重要的：每个细胞都是一个个体，但必须与周围的细胞协调活动。因此，生物学家真正想要的是一种可以单独研究每个细胞中单个分子的方法，然后将结果关联起来。
这是一项艰巨的任务，但是生物化学、微流体学、生物信息学和细胞培养的最新进展已经在填补这一空白方面取得了长足的进步。如今，研究人员可以对基因组DNA或信使RNA进行测序、对蛋白质进行编目，或者对单个细胞的染色质结构进行表征，并在实验中数百次甚至数千次地重复这一过程，生成非常详细的个体和集体细胞活动图像。随着这些单细胞技术的不断发展，科学家们正在采取下一个合乎逻辑的步骤，即结合分析，一次性研究每个细胞中两个或更多参数。
分离不等于均等
最初，研究人员试图从单独的细胞中合成单细胞数据。例如，通过对一个样本进行单细胞信使RNA测序，并对备份样本进行染色质可及性分析。他们假设每个样本中都有完全相等的细胞，然后通过计算将这些模式联系起来。“然而，即使这些细胞来自同一个原始样本，试图将细胞之间的不同模式联系起来也存在计算上的挑战。”位于加利福尼亚州普莱森顿的10X Genomics公司创始科学家Michael Schnall-Levin表示。
最近，细胞生物学家和技术公司开发了新一代方法，被称为单细胞多组学、下一代多组学或多模态组学，其旨在单个样本上进行单细胞水平的复合分析。单细胞多组学不是通过计算合成相关性，而是以多种方式直接观察每个细胞。“一些最早的方法可以同时检测来自同一细胞的RNA和蛋白质，如CITE-seq技术和REAP-seq技术；或检测来自同一细胞的RNA和CRISPR引导RNA，如Perturb-seq技术。”Schnall-Levin说。虽然最初的概念验证实验集中在免疫细胞上，但现在单细胞多组学也在癌症研究中获得了关注。
不管他们想要跟踪的参数是什么，不熟悉单细胞分析的研究人员应该花一些时间考虑样品制备。“在测量具有不同稳定性的分析物时，这一点尤为重要……我想说，样品准备和实验方法是一种平衡，以确保不同分析物能同时以最好的方式被检测到。”Schnall-Levin表示。
一旦实验室部分完成，单细胞多组学就呈现出独特的生物信息学挑战。每增加一个分析物就意味着又多了一层需要处理的数据，也增加了研究人员需要处理的信息总量。不过，多组学方法也有一些补偿性优势。“联合测量‘—组学’消除了为推断不同单细胞数据集之间关系而采用计算策略的需求。”Schnall-Levin解释道。
作为单细胞测序技术的主要供应商，10X Genomics公司已经调整了其产品线以迎合迅速发展的多组学趋势，该公司现在销售用于分析几种不同靶标组合的设备和试剂。Schnall-Levin预计，这些产品将随着该领域的发展而不断增多。特别是，他预计研究人员会将更多类型的分析结合到单个实验中。事实上，一些免疫学家已经在单细胞水平上一次测量多达5个参数，并且这个数字似乎还在增长。
让液滴“排排队”
随着研究人员在单细胞实验中增加更多的分析维度，他们遇到了一些棘手问题。“人们研究多组学的典型途径是在RNA上添加其他简单分子，如蛋白质或表观遗传标记……这在全基因组和全转录组水平上很容易得到。”位于加利福尼亚州南旧金山的Mission Bio公司软件和信息学副总裁Anup Parikh表示。
虽然将单个细胞中的转录组和表达蛋白质组相关联提供了有用的交叉检查，但研究人员越来越想进行包括完全正交特性的测量，如细胞的染色体拷贝数或基因组序列。由于DNA测序需要破坏细胞，因此它与需要完整细胞且同步进行的转录组或蛋白质组分析并不兼容。
为了解决这个问题，Mission Bio公司提供了一种微流体系统，其可以对单个细胞进行一系列分析，同时跟踪每个细胞在其中的过程。该系统从悬浮液中分离出单个细胞，将每个细胞分离成带有分子条形码的液滴。然后，这些带条形码的液滴会像传送带上的包裹一样，通过Mission Bio公司设备上的微流体通道，“拜访”进行不同分析的反应室。
“我们不会在这个过程中失去任何东西，但是可以用一些蛋白酶处理来打破细胞的反应，与用聚合酶来扩增DNA或分析蛋白质以及细胞外的其他任何东西的反应分开。”Parikh说道。通过将非破坏性步骤置于破坏性步骤之前，该系统可以从每个细胞中获得蛋白质组学、转录组学、基因组学和表观基因组学数据。
拥有如此多的选择，研究人员必须小心不能贪多嚼不烂。“当处理这些类型的项目时，它很快就会变得复杂，所以你要确保有一个真正有根据的科学问题，因为其可以产生巨大的数据集。”Mission Bio公司转化应用和市场开发主管Aaron Llanso指出。
这种关注也影响了该公司的数据处理方法。“我们采取了一种非常有条理的方法来构建有助于我们的科学家和制药公司的应用程序的信息学解决方案。这不是一种猎枪式的方法，我们有通用工具，更多的是‘我能帮助回答一个关于特定癌症类型中癌症克隆进化的问题吗’?”Parikh说。
越过彩虹
鉴于微流体可对细胞和试剂进行精细控制，其他公司为特定类型的单细胞分析提供微流体解决方案不足为奇。对位于密苏里州圣路易斯市的Canopy生物科学公司来说，这意味着要更新古老的免疫荧光显微镜技术。传统上，研究人员用不同颜色的荧光染料标记抗体，一次可视化几种不同细胞蛋白的表达，但这种方法只适用少数几个表位。细胞表达的蛋白质要比荧光染料标记的颜色多得多。
Canopy公司的微流体系统会进行自动化荧光标记和图像处理，然后重复它们。“我们以迭代的方式进行染色，以建立真正的高复合分析，所以你可以（在微流控芯片上）用多达5种抗体的混合物进行染色，收集这5种抗体的图像数据，接着擦掉荧光信号，然后再次染色。”Canopy公司产品经理Thomas Campbell说。系统将图像数据堆叠起来，绘制出样本中每个细胞所有蛋白质的表达图谱。虽然芯片的容量没有任何限制，但到目前为止，通常它每次可实验分析20至50个蛋白质。
芯片还能保存细胞。“你可以把样本存放在冰箱里长达两年，然后把它拿出来并从你停下来的地方继续，在之前分析的基础上重新审视样本。”Campbell表示。对于研究宝贵临床样本的研究人员来说，这可能是一个特别有用的功能。这也意味着，随着技术的不断发展，用户能够将新技术应用于以前的样本。
原则上，Canopy系统可以用在任何传统上依赖免疫荧光的领域。“该平台的优点之一是它在样本类型方面非常灵活，我们可以做组织切片，包括新鲜的、冷冻的以及用福尔马林固定石蜡包埋的，还可以做各种不同的细胞悬浮液。”Campbell说，目前大多数客户都在免疫学或肿瘤学领域工作，但该公司还支持新冠病毒免疫分析研究和神经科学应用。
排序困境
微流体并不是实现单细胞多组学的唯一途径。事实上，对免疫学家而言，分离并分析单个细胞并不是一种新观念。多年来，他们一直在使用流式细胞仪以多种方式分离并研究荧光标记细胞。位于新泽西州富兰克林湖的BD生物科学公司是流式细胞仪设备的主要制造商之一，该公司现在也销售一整套为单细胞多组学量身定制的附加组件。
事实上，BD公司现在销售几乎涵盖了单细胞多组学实验的整个流程——从采血管、细胞分离缓冲液到流式细胞仪——的一系列设备、耗材和试剂。
“一旦（流式细胞术富集）完成，我们就会进入BD Rhapsody系统，这是一个非常独特的单细胞分割系统。”BD公司高级营销总监Ranga Partha说。Rhapsody微孔设计旨在保护脆弱的细胞，如粒细胞、中性粒细胞和干细胞，而且该系统还包括一个用于视觉质量控制的扫描设备。用于蛋白质和RNA分析的辅助设备和试剂，无论是靶向还是跟踪整个转录组，都会使系统更加完善。该公司还在开发一种可变的、多样化和可连接[V（D）J]测序的系统，该系统将表征单细胞中的抗体基因重排。
虽然目前Rhapsody检测显然是针对免疫学家的，但该领域与癌症研究的重叠并未逃过该公司的注意。“我相信这项技术未来将专注于肿瘤领域生物标志物的发现。”Partha指出。
然而，即使对具有丰富流式细胞仪技术经验的科学家而言，单细胞多组学也面临着独特的挑战。Partha指出，样品制备、细胞活力检测和生物信息学是该领域新人面临的三大障碍。“让技术娴熟、训练有素的研究人员完成这三项工作是一项挑战。”
为了解决这个问题，他敦促研究人员与做过类似实验的同事交谈，并与出售试剂和设备的公司联系。“我认为与提供检测的公司的技术应用专家进行对话是一个很好的步骤……但研究人员有时会忽略它，他们继续进行实验，最后数据的复杂性会变得非常高。”Partha说，与该领域的其他专家一样，生物信息学是一个不断发展的挑战，随着研究人员在单细胞实验中增加更多实验，这个挑战可能会变得更加重要。
寻求专业帮助
尽管困难重重，但单细胞多组学的普及速度几乎与实验的复杂性上升速度一样快。“这绝对是一个热门的新兴领域。”位于新泽西州南普莱恩菲尔德的Genewiz公司临床开发服务主管Haythem Latif表示。不过，并不是每个对该领域感兴趣的人都有能力进行深入研究。幸运的是，像Genewiz这样的研究公司很乐意帮助那些愿意把部分或全部实验工作外包出去的研究人员。
当选择一家服务公司时，科学家期望花一些时间讨论他们的研究、想要解决的具体问题以及公司可以提供的技术。“我们合作得很好……确保这些类型的技术参数与手头的生物学问题相匹配。”Latif说。这些早期的谈话可以避免以后的麻烦。“如果你在生物学上做的事情存在一些可行性问题，这些问题可能会被提出或者以不同的方式处理。”Latif表示。
服务提供商应该始终为每个项目定制方法，但在许多情况下，他们会集中在老生常谈的路径上。例如，最近一种流行的策略是在单细胞水平上应用10X Genomics公司的转录组学分析技术和表面蛋白标记来获取相应的蛋白质组学信息。“这是一个非常简洁的工作流程，它是与许多客户一起开发的……为了把这两条信息结合起来。”Latif说。他补充道，研究人员还开始增加空间分析，以便定位细胞表面的蛋白质。
到目前为止，肿瘤学家和免疫学家是单细胞多组学最大的应用者。Genewiz公司代表指出，其他领域也在研究这项技术。“干细胞分化和多能性领域对单细胞多组学有很大兴趣……有助于描述干细胞及其分化过程，其在神经科学领域也得到了应用。”该公司首席科学家Dave Corney说。
不管他们追求的具体策略是什么，专家们一致认为，单细胞多组学才刚刚起步，未来发展潜力巨大。“人体有40万亿个细胞，这些细胞一直在变化。为研究人员提供工具来研究这些发现，将使我们更了解癌症、阿尔茨海默病或心脏病的病因——这就是我们想要做的。”Schnall-Levin说。■
Alan Dove 是马萨诸塞州的科学作者和编辑。
鸣谢：“原文由美国科学促进会（www.aaas.org）发布在2021年9月24日《科学》杂志”。官方英文版请见https://www.science.org/content/article/combine-and-conquer-single-cell-omics-multiplies。